微生物急性毒性检测

1.一种污水急性生物毒性的检测方法，其特征在于，该方法按下列步骤进行：

　　步骤一，样品处理：

　　按照标准取样方法采取污水样，并对样品进行如下处理：

　　(1)依次将7mL的二氯甲烷、7 mL的甲醇、7mL的纯水通过C18固相萃取小柱对柱子进行润湿活化;

　　(2)取500 mL经0.45μm滤膜过滤后的污水样上柱，使污水样连续通过C18固相萃取小柱，并调节真空泵使流出液流速为3mL/min;

　　(3)待污水样全部流出柱后用5 mL纯水过洗柱子，接着继续真空抽气干燥15min，而后将C18固相萃取小柱放入离心机中离心;

　　(4)用二氯甲烷洗脱柱子，收集洗脱液，并将所得洗脱液用高纯氮气吹干，用5mL体积分数为0.5%的二甲基亚砜溶解所得吹干物，得到浓缩样品溶液;

　　(5)将浓缩样品溶液用0.9%的生理盐水配制成系列浓度梯度的待检测样品溶液;

　　步骤二，青海弧菌Q67菌悬液的制备：

　　(1)将青海弧菌Q67菌种转接到50 mL液体培养基中，22℃条件下，培养10～12 h;

　　(2)将得到的菌体培养液在12000 rmp 条件下离心10 min 后弃去上清液，接着对沉淀的菌体细胞进行3次洗涤：即用10mL 0.9%的生理盐水重悬、12000 rmp 离心10 min，将经洗涤的菌体细胞用10 mL0.9%的生理盐水重悬，得到青海弧菌Q67菌悬液;

　　步骤三，污水样急性生物毒性的检测：

　　对步骤一中所得到的每个待检测样品溶液进行如下检测：

　　(1) 在1.5 mL样品检测管中加入100 μL待检测样品溶液，并取100 μL 0.9%的生理盐水加入1.5mL对照检测管中作为空白对照样，其中样品及空白对照样均有3~5个平行样;

　　(2)上述各检测管中分别加入100 μL青海弧菌Q67菌悬液，且各检测管之间加菌悬液的时间间隔为15 s;

　　(3)菌悬液加入完900s后，采用发光细菌检测仪，按照加青海弧菌Q67菌悬液的检测管的顺序，依次对各样品及对照样进行发光强度检测，读取其相对发光值;

　　步骤四，结果计算：

　　(1)计算出对照样的相对发光值平均值I0和不同浓度待检测样品的相对发光值平均值I，按(式A)计算出不同浓度待检测样品对发光细菌的相对抑制率E;

　　(式A)

　　(2)以待检测样品的浓度为纵坐标，以不同浓度待检测样品的相对抑制率E为横坐标作定量标准曲线，并从该曲线上读取出相对抑制率为50%时所对应的浓度，即半数发光抑制率浓度EC50，EC50值越大，毒性越小;

　　(3)用(式B)计算总影响指数TII50，并以此来反映污水样品的生物毒性，TII50 值越大，毒性越大;