飞凡检测集团针对C型逆转录病毒的数字PCR检测用引物及检测方法与流程

本申请属于病毒检测技术领域，具体涉及一种针对c型逆转录病毒（c-typeretrovirus）的数字pcr（dpcr）检测技术专利申请事宜。

飞凡检测背景技术：

中国仓鼠卵巢(cho)细胞是一种药用重组蛋白和疫苗生产中的常用细胞，其具有如下优良特点：(1)适用于悬浮培养，可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；(2)产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；(3)所含人类病毒极少；(4)外源基因可以在cho细胞中稳定地整合；(5)cho细胞是成纤维细胞，几乎不分泌内源性蛋白，对目标重组抗体的分离纯化工作十分有利。

cho细胞中没有人类病毒，并且应用较为广泛。但已有研究也已证实，cho细胞可以表达内源性逆转录病样颗粒，在细胞上清中通常可以检测到103~109/ml的逆转录病毒样颗粒，尤其是通过电子显微镜可以清楚观察到cho细胞中含有c型逆转录病毒颗粒。也为了保证在cho细胞中表达生产的抗体药和疫苗等重组蛋白药物的安全性，需要在生产环节和纯化后对相关病毒颗粒量进行准确检测和定量，尤其是cho细胞系中c型逆转录病毒的定量检测。

现有技术中，*常用的分子检测方法是荧光定量pcr（qpcr）法，其可以通过利用taqman探针法特异性检测c型逆转录病毒颗粒的含量。由于每个逆转录病毒颗粒包含两个病毒基因组rna分子，通过检测病毒基因组rna拷贝数，便可以推算出每制剂的病毒含量。但由于荧光定量pcr属于相对定量，在具体**定量病毒拷贝数时需要先用标准品绘制标准曲线，由此导致病毒拷贝数检测结果主要取决于标准品（标准曲线）的准确性。但实际检测定量中，影响定量pcr检测结果的准确性因素还有：扩增效率、pcr干扰因素、标准品的准确性等诸多因素。c型逆转录病毒的定量检测时，一般是取cho细胞培养上清来纯化病毒核酸，而上清中大量的细胞碎片、蛋白、杂质核酸等杂物，也会干扰pcr扩增，进而导致检测结果不准确。正是基于这些问题，急需一种较好的、较为简便的病毒拷贝数准确定量方法，从而为相关病毒含量的准确确定奠定基础。

数字pcr技术作为第三代pcr技术，是一种单分子扩增技术，是一种不依赖标准品的**定量技术。与传统的荧光定量相比，可实现单分子检测，具有检测准确性高、灵敏性高和抗pcr扩增抑制能力的优点。与qpcr相同，数字pcr技术可以利用taqman探针或sybrgreen染料进行荧光信号检测，*后利用终点信号检测法和泊松分布统计计算，实现样品的**定量。

鉴于qpcr在cho细胞的c型逆转录病毒检测中仍然存在明显改进空间，如何利用数字pcr技术来实现和改进cho细胞中c型逆转录病毒检测工作，对于确保相关产品质量的稳定性具有十分重要的技术意义。

飞凡检测技术实现要素：

针对现有cho细胞中的c型逆转录病毒，本申请目的提供一组针对c型逆转录病毒的数字pcr检测用引物，从而为相关病毒颗粒的准确检测和定量奠定一定技术基础。