细菌内毒素检测是确保药品和医疗器械安全性的重要环节,特别是在预防革兰氏阴性菌感染方面。传统的细菌内毒素检测方法依赖于鲎试剂(LAL)测试,但这种方法存在一些局限性,如对动物源性成分的依赖和可能的假阳性结果。为了克服这些限制,重组C因子法(rFC)被开发出来,并逐渐被认可和采用。
重组C因子法(rFC)的原理和优势:
原理:重组C因子法是通过体外重组技术生产鲎凝血级联反应的第一个组分——C因子。这种方法模拟了鲎血液中的天然反应,但不依赖于鲎血,因此避免了对动物的依赖和相关的伦理问题。
优势:
高特异性:rFC法具有更高的特异性,能够有效区分内毒素和其他可能引起假阳性的物质,如β-1,3-葡聚糖。
供应安全性:由于不依赖动物源性成分,rFC法提供了更高的供应安全性和批间一致性。
操作简便:rFC法通常只需一步反应,简化了操作流程,提高了检测效率。
宽动态范围:rFC法的检测范围较广,能够覆盖从0.005到5EU/ml的内毒素浓度。
符合3R原则:即替代(Replacement)、减少(Reduction)、精炼(Refinement),rFC法是动物试验的替代方法,符合现代科学和伦理要求。
合规审批历史:
美国:2012年6月,美国食品药品管理局(FDA)发布了指南文件,将rFC法作为LAL法的替代方法。2018年9月,FDA首次批准使用rFC法进行细菌内毒素放行检测的药物。
欧洲:2015年7月,欧洲药典将rFC法列为替代LAL和家兔热源测试的内毒素检测方法。2019年1月,中国药典也将rFC法列为细菌内毒素检测方法。
检测流程:
标准内毒素贮备液制备:使用经过guojibiaozhun标定的内毒素标准品制备贮备液。
供试液制备:溶解或稀释原料药或制剂制备供试液,必要时调整pH值。
Zui大有效稀释度确定:根据试剂盒或药典描述的方法进行确定。
荧光定量检测:基于内毒素浓度和试剂混合物在孵育结束后的荧光之间的定量关系。
预检测:确保荧光技术有效性,证明供试液对检测无干扰。
标准曲线标准:使用标准内毒素溶液制作标准曲线,相关系数|r|必须大于等于0.980。
干扰因子测试:评估供试液中是否存在干扰因子,并采取适当的处理方法消除干扰。
重组C因子法为细菌内毒素检测提供了一种高效、准确且符合伦理要求的替代方法。随着全球对动物福利和可持续性的日益关注,rFC法有望成为未来药品和医疗器械内毒素检测的主流方法。