项目一：黑色素含量测定
【实验原理】
体内黑色素主要由位于表皮基底细胞层的黑色素细胞产生，是一种由细胞本身所合成、分泌不溶于水，溶于碱性溶液的生物色素。黑色素的产生过程受多因素调控，其中外界刺激(尤其是紫外线照射)、炎症反应和α-MSH激动剂均可触发或影响黑色素的合成过程。本实验利用人黑素瘤细胞在样品作用下通过NaOH裂解法检测黑色素含量进而评价样品是否具有美白功效。^
【实验步骤】
实验一：MTT法检测样品对人黑色素瘤细胞的细胞毒性实验
1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1 × 10^4个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。
2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24h。
3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。
4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。
OD490：490 nm处的吸光度值
实验二：人黑色素瘤细胞的黑色素含量测定实验
1）细胞接种：接种细胞于12孔平板（5 × 104个/孔），于37 ℃，5% CO2孵育24 h。
2）造模+给药：去除培养液，用D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次。正常对照组更换为新鲜培养基，样品组更换为含造模剂（α-MSH）和样品的新鲜培养基，模型对照组更换为含造模剂（α-MSH）的新鲜培养基，继续于37℃，5% CO2孵育48 h。
3）收样检测：孵育结束后，去除培养液，用D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次，每孔加入200 μL1mol/L的NaOH溶液（含10% DMSO），60 ℃孵育1 h.。将12孔板中各组的细胞溶出物转移到96孔板中，在475nm处测定各孔的吸光度值。
注：上述给药浓度均来MTT实验摸索而定。
【评价指标】
黑色素含量
【评价结论】
供试品组与对照组相比，黑色素含量下调且具有显著性差异（P＜0.05），初步证明该样品具有美白功效。
【参考结论】
[1] 殷珊.栀子黄色素对小鼠B16黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影响的实验研究[D].湖南中医药大学.
[2]庄文越,苏小明,赵鸣瑶,等.安五脂素对α-黑色素细胞刺激素诱导的小鼠黑色素瘤B16F10细胞中黑色素生成的影响及机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2022,36(5):6.
[3] 解士海, 黄荣云, 赵卫华,等. 紫草素对人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响[J]. 临床合理用药杂志, 2010,3(9):10-12.
[4] 刘邦民, 张涓, 陶春蓉,等. 验方祛斑汤含药血清对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响[J]. 美中医学：英文版,2007, 4(6):4.
项目二：酪氨酸酶活性测定
【实验原理】
酪氨酸酶是黑色素合成的关键限速酶，在治疗色素障碍性皮肤病中，酪氨酸酶抑制剂发挥着重要作用，近年来，以酪氨酸酶抑制剂作为美白剂开发的美白祛斑产品均能达到一定功效。通过多巴氧化法检测样品对人黑素瘤细胞（A375）中酪氨酸酶活性是否降低，来判断样品是否具有美白功效。
【实验步骤】
1）细胞接种：接种人黑素瘤细胞（A375）于96孔板中，每孔5 × 104 个，37 ℃培养24 ± 2 h。
2）给药：空白对照组（不含细胞）和正常对照组（含细胞）加入完全培养基，样品组加入含相应浓度样品的完全培养基，37 ℃，5%CO2孵育48 h。
3）收样检测：孵育结束后，去培养基，采用多巴氧化法测酪氨酸酶活性。
上述给药浓度均来MTT实验摸索而定。
【评价指标】
酪氨酸酶活性
【评价结论】
供试品组与对照组相比，酪氨酸酶活性上调且具有显著性差异（P＜0.05），初步证明该样品具有美白功效。
【参考结论】
[1]杨美花，李智聪，刘凤娇，庄江兴，王勤，陈清西.L-半胱氨酸作为化妆品美白添加剂的作用机理[J].厦门大学学报，2009，48（4）：581-584.
[2]黄海潮，郑公铭，王如意，张显策，李忠军，刘纲勇，傅中.柯里拉京对B16细胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用[J].日用化学工业，2016，46（1）：44-47.
项目三：黑素合成相关基因-MITF、TYR表达测定
【实验原理】
皮肤是抵御各种有害刺激的物理屏障，包括紫外线照射、环境污染、机械损伤和体内水分流失。特别是，过度的紫外线照射会导致DNA损伤和基因突变，从而导致皮肤癌的发生。因此，皮肤使用黑色素，一种由表皮基底细胞层中的黑色素细胞产生的天然色素，来保护皮肤免受过度的紫外线照射。黑色素的产生被称为黑色素生成级联，包括基因表达、酶反应和膜运输。素生成级联始于黑素细胞，通过激活G蛋白偶联受体，黑素皮质素1受体(MC1R)，对α-黑素细胞刺激激素(αMSH)作出反应，αMSH作为黑色素生成的内源性诱导物，通过级联磷酸化激活黑色素合成相关基因转录因子-黑素细胞诱导转录因子（MITF），包括黑素生物合成酶酪氨酸酶家族的基因表达，例如酪氨酸酶(TYR)。因此，本实验利用人源黑色素瘤细胞（A375），将样品作用于细胞后检测MITF、TYR基因相对表达量，以此维度来评估样品对黑色素合成的影响。
【实验步骤】
细胞接种：接种A375细胞于6孔板中，每孔6 × 105个，37 ℃，5% CO2培养24 h。
造模＋给药：去除培养液，用D-Hanks轻柔冲洗细胞一次或两次。正常对照组更换为新鲜培养基，样品组更换为含造模剂（α-MSH）和样品的新鲜培养基，模型对照组更换为含造模剂（α-MSH）的新鲜培养基，继续于37℃，5% CO2孵育48 h。
收样检测：培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。
用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。
【评价指标】
MITF、TYR基因表达
【评价结论】
供试品组与模型对照组相比MITF、TYR基因表达下调且具有显著性差异（P＜0.05），初步证明该样品具有美白功效。
【参考结论】
[1] Waku T, Nakada S, Masuda H, Sumi H, Wada A, Hirose S, AketaI, Kobayashi A. The CNC-family transcription factor Nrf3coordinates the melanogenesis cascade through macropinocytosis andautophagy regulation. Cell Rep. 2023 Jan 31;42(1):111906.
[2] 殷珊.栀子黄色素对小鼠B16黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素生成影响的实验研究[D].湖南中医药大学.
[3]庄文越,苏小明,赵鸣瑶,等.安五脂素对α-黑色素细胞刺激素诱导的小鼠黑色素瘤B16F10细胞中黑色素生成的影响及机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2022,36(5):6.
[4] 解士海, 黄荣云, 赵卫华,等. 紫草素对人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响[J]. 临床合理用药杂志, 2010,3(9):10-12.
[5] 刘邦民, 张涓, 陶春蓉,等. 验方祛斑汤含药血清对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响[J]. 美中医学：英文版,2007, 4(6):4.