实验原理
实验步骤
细胞准备:取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞悬液。
细胞计数:进行活细胞计数,并调整细胞密度至适宜浓度(通常为1×10^3至40×10^4个细胞/mL)。
制备底层琼脂:将低熔点琼脂糖与培养基混合,高压灭菌后保持在42℃左右,注入培养皿中形成底层琼脂。
制备上层琼脂:将细胞悬液与上层琼脂混合,迅速均匀地倒入已凝固的底层琼脂上。
培养:将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养2-3周。
克隆计数:培养结束后,将培养皿倒置在显微镜下,用结晶紫等染料染色,计数克隆数。
计算克隆形成率:根据公式计算克隆形成率,即集落数除以接种细胞数再乘以。
注意事项
细胞悬液制备:确保细胞完全分散,避免细胞团形成。
接种密度:接种细胞的密度不宜过大,以保证细胞有足够的空间形成克隆。
琼脂温度:混合细胞与琼脂时,琼脂的温度不宜过高,以免损伤细胞。
避免污染:实验操作过程中要注意无菌操作,避免污染。