苏州化妆品眼刺激性试验 BCOP试验方法检测

化妆品眼刺激性试验

角膜细胞的特征是有丝状肌动蛋白在活细胞中保持聚合，一旦ATP再生停止会迅速解聚。在离体的牛角膜中，已固定活细胞的丝状肌动蛋白可被罗丹明标记的鬼笔环肽染色来标记。

有研究表明，物质的眼刺激性程度与损伤深度(depthofinjury，DOI)直接相关，可依据损伤深度来对眼刺激性进行分类。

BCOP方法用于化妆品眼刺激性评价主要通过鬼笔环肽对角膜冰冻切片的完整丝状肌动蛋白骨架染色来进行标记，进而明确暴露于受试物后的牛角膜的上皮和基质损伤深度，对损伤深度进行量化，进而对轻微和中等刺激进行准确细分。

BCOP试验方法

选用完好的角膜(无肉眼可见混浊、划痕和其他异常情况)，取角膜时保留2~3mm的巩膜边缘以便于后续处理，小心注意避免损伤角膜上皮和内皮。分离的角膜安装在特殊设计的角膜固定器中，角膜固定器包括前室和后室，连接处分别是角膜的上皮和内皮。两腔室内都充满了预热的MEM培养液，确保没有气泡。在(32±1)℃培养箱中平衡1h后，更换前后室培养液测量初始浊度值。

分组后移除前室培养液后加入750mL受试物。暴露10min后，用MEM冲洗至样品无残留后，加满无酚红MEM培养液后暴露2h。将前后室培养液换新后读取终末浊度值。移除前室培养液，加入1mL的4mg/mL荧光素钠溶液，孵育90min后，收集后室液体，混匀后取360L在490nm波长处读取吸光度值，按公式计算体外刺激评分值(invitroirritancyscore，IVIS)。

每个样品平行6只角膜，阴性对照：纯化水，阳性对照：无水乙醇，3只角膜在完成BCOP测试后用于计算IVIS，3只角膜在后暴露完成后用于固定染色。按照0ECD指南标准：IVIS≤3，为无刺激性(GSH的不分类级别)；3<IVIS≤55，为轻微到中等刺激(GSH的2B和2A类)；IVIS>55，为严重刺激(CSH的1类)。

Draize试验方法

参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中“急性眼刺激性/腐蚀性”项下所示方法，实验前24h肉眼检查后，再用荧光素钠及裂隙灯对双眼进行检查：每个样品取没有眼病的健康家免3只，将0.1mL的样品加入一侧结膜囊中，眼闭合1s，至第30s时用足量流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗30s，另侧眼睛不处理作自身对照，在滴入受试物后1，24，4872h以及第4和7天对动物眼睛进行检查。

如果72h未出现刺激反应，即可终止试验。对于7d不恢复者，需延长观察时间，一般不超过21d。按《化妆品安全技术规范》(2015年版)要求判定受试物对眼的刺激强度。