一、材料
⒈受试样品固体受试样品应溶解或悬浮于适合的溶剂中,并稀释至一定浓度。液体受试样品可直接使用或予以稀释。受试样品应在使用前新鲜配制,否则必须证实储存不影响其稳定性。
⒉阳性对照可根据受试样品的性质和结构选择适宜的阳性对照物,应是已知的断裂剂,能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时,可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯(methyl methanesulphonate, MMS )、甲磺酸乙脂(ethyl methanesulpho-nate,EMS)、(mytomycin C )、乙基亚( ethyl nitrosourea,ENU)、硝基喹啉-N-氧化物(4-nitro)等。当存在外源性活化系统时,可使的阳性对照物有苯并(a)芘(benzo(a) pyrene,BaP )、环磷酰胺(cyclophosphamide)等。
⒊阴性对照水或水溶性溶剂,亦可使用二甲基亚砜(DMSO),但浓度不应大于0.5%。
⒋细胞株可选用中国地鼠肺(CHL)细胞株或卵巢(CHO)细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞。
⒌肝混合功能氧化酶混合液(S9混合液)。
⒍0.04%秋水仙素溶液。取40mg秋水仙素溶解于100m1无菌0.85%氯化钠溶液中,过滤除菌。
⒎0.075mol/L溶液
⒏固定液甲醇:冰醋酸=3:1,临用前配制。
⒐吉姆萨染液取吉姆萨染料3.8g,置玛瑙乳钵中,加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375ml,待完全溶解后,再加125ml甘油,放入37℃温箱中保温48小时。保温期间振摇数次,使充分溶解。取出过滤,2周后使用,作为吉姆萨染液原液。使用时,取1份吉姆萨染液原液,与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)混合。
⒑磷酸盐缓冲液(1/15mol/L, pH6.8)。使用时,取1份吉姆萨染液原液,与9份1/15mo1/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)混合,配成其应用液。
二、方法
⒈细胞培养与染毒。试验需在加入和不加入S9的条件下进行。将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中,放C02培养箱内培养。试验时吸去培养皿(瓶)中的培养液,加入一定浓度的受试样品、S9混合液(不加s9混合液时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,放培养箱中,根据细胞周期决定处理2~6小时。结束后,吸去含受试样品的培养液,用Hanks液洗细胞3次,加入含10%胎牛血清的培养液,放回培养箱,于24小时内收获细胞。于收获前2~4小时,加入细胞分裂中期阻断剂(如用秋水仙素,作用时间为4小时,终浓度为1ug/ml)。
⒉用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞脱落后,加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用,混匀,放入离心管以1000~1200r/min的速度离心5~7分钟,弃去上清液。
⒊加入0.075mol/LKCl溶液7ml,用滴管将细胞轻轻地混匀,放入37℃水浴中低渗处理7分钟,加入2ml固定液(甲醇:冰醋酸3:1)混匀,以1500r/min速度离心5~7分钟,弃去上清液。
⒋加入7ml固定液,混匀后固定7分钟,以1500r/min速度离心7分钟,弃去上清液。用同法再固定1~2次,弃去上清液。
⒌加入数滴新鲜固定液,混匀。用混悬液滴片,自然干燥。用吉姆萨染液染色。
⒍选择100个分散良好的中期分裂象,在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目,对于畸变细胞还应记录显微镜视标位置及畸变类型。所有处理组、阳性和阴性对照组均需测定有丝分裂指数。每一剂量组应分析不少于500个分散良好的中期分裂象。