蛋白偶联 半抗原与载体蛋白的偶联方法与检测 载体蛋白偶联 蛋白偶联标记修饰技术服务

摘要

你的偶联方式是什么？其质量如何？

小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度与其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的确定性、可溶性和理化特性等因素的影响。

通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法，常见的偶联方法如下。

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1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联

1.1混合酸酐法

混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，在与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。

1.2碳二亚胺法

碳二亚胺（EDC）使羧基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。EDC被称作为零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。此方法连接十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1-2h，置室温24h，再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。

2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联

2.1戊二醛法

双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键（-N=C＜），在半抗原和蛋白质间引入一个五碳桥。这一反应条件温和，可在4-40℃及pH6.0-8.0内进行，操作亦简便，应用广泛。

戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，**使用新鲜的戊二醛。

2.2 重氮化法

用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。

3、含羟基半抗原的偶联

3.1琥珀酸酐法

半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯（带有羧基的中间体），再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基。

3.2羰基二咪唑法

N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂。含羧基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端（α-氨基）和赖氨酸侧链的（e-氨基）和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。

当半抗原与载体蛋白偶联形成人工抗原后，其质量如何？是否符合下游应用的要求？其评定方法如下。

1、偶联比的测定

1.1分光光度法

如果半抗原的紫外*大吸收大于220nm（蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外*大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠），则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数。

1.2标记抗原示踪法

在制备半抗原-蛋白质结合物时，向反应液中加入一定量的标记半抗原，反应完成后，未结合的半抗原经透析除去，测定透析前后的放射性强度，就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。如果不用透析，也可取一定量反应后的溶液，加入蛋白质沉淀剂或有机溶剂以提取结合的半抗原，测定半抗原-蛋白质结合物的放射性。同样可以计算出半抗原与蛋白质的偶联比。

2、浓度测定

人工抗原的**含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的（这里也反映出人工抗原越纯，检出的浓度值愈准确）。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯氏定量法、染色结合法和荧光法等。

3、纯度鉴定和结构分析

鉴定农药人工抗原*常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。半抗原与载体分子反应后是否真正的连接在一起，如果发生连接，它们的连接基团又在哪里。这些问题可以通过红外吸收光谱图或质谱分析得到解决。

利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。前者适应范围广，但鉴别的灵敏度较低。后者是用于大分子酶标记物和某些半抗原偶联物的纯度鉴定。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有游离的未偶联的物质。