端粒酶活性检测（PCR-Elisa法）

进行端粒酶活性检测可间接考察细胞是否有成瘤的可能性。因为质量研究需要我们需要对我们的产品进行端粒酶活性检测，网络上的检测步骤五花八门，飞凡检测小编结合本公司端粒酶活性检测的操作规程。本文更多是小编对质量研究过程的吐槽。欢迎拍砖。

1.检测原理

本法利用PCR-Elisa（聚合酶链式反应-酶联免疫）检测手段检测端粒酶活性，原理：

步骤1：延伸/扩增

第一步，端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）添加到生物素标记的合成P1-TS引物的3′端。使用引物P1-TS和锚定引物P2，通过PCR对这些延伸产物以及包含在相同反应容器中的内标（IS）进行扩增。来源于第一步中端粒酶介导的延伸产物的PCR产物含有端粒酶特异性六核苷酸增量，而内标（IS）产生216-bp的PCR产物。

步骤2：ELISA检测

将PCR产物分成两等份，变性，分别与地高辛-(DIG)标记的检测探针杂交，所述探针分别对端粒重复序列（P3-T）和内标（IS）（P3-Std），具有特异性。通过生物素标记将所得产物固定到涂有链霉亲和素的微孔板上。用地高辛抗体检测固定的扩增子，该抗体与辣根过氧化物酶（抗DIG-HRP）和灵敏的过氧化物酶底物TMB缀合。

端粒酶活性检测（PCR-Elisa法）原理图（图片来源于网络，仅供学习交流用）

2.检验程序

2.1供试品细胞

2.1.1供试品取样应当具有代表性

产品、中间产品产生细胞悬液直接取得供试品细胞。

2.1.2细胞类制品原辅料的的检验数量及检验量

送检供试品细胞检验量不低于2.5×105细胞数量，注明细胞数量。每个供试品送检验数量以2或3为适宜。

2.1.3供试品处理及转移

供试品送检样本类型如为细胞悬液，常温条件下运输转移。

供试品送检样本类型如为细胞沉淀，使用1.5ml规格无菌离心管进行沉淀、转移。短暂存放4℃，冰上转移。长时间存放-80℃冷冻保存，干冰长途运输转移。

2.2对照细胞

2.2.1使用iPSC细胞作为对照细胞1

2.2.2使用HDFn细胞作为对照细胞2

2.3细胞样本处理

2.3.1供试品细胞沉淀获得

取一定数量（如，2×105个细胞）细胞悬液，3,000g,5min（2~8℃）离心获得沉淀。可-80℃保存细胞沉淀。

2.3.2供试品制备

冰上裂解细胞，加入样本裂解液（管序号1）至细胞浓度1×103细胞/μL，加入裂解液（如，200μL），裂解30min。16,000g,20min（2~8℃）离心，小心取上清175μL。（按照25μL/支分装，可-80℃保存备检。）

2.3.3供试品阴性对照制备

取制备的供试品分装样本1支，取20μL，加入2μL核糖核酸酶A（1mg/ml），37℃，20min。

或者使用加热灭活的方式直接制备供试品阴性对照。制备的供试品分装样本1支，85℃，10min。

吐槽1：*近莫名的烦躁，看见某些人输出的检验方法总让人火大。只考虑方法本身甚至就是黏贴说明书，很少思考检验的全过程。在质量研究早期缺少体系管理文件的当下，输出的方法不仅是要保证检验方法可行要考虑检验前和检验后，检验前需要确保工艺研究能便捷快速的提供需要的样本，检验后输出的数据又要考虑后续进行质量评价时数据可比等。

作为一个初入细胞质量行业做质量研究的小白，发现人的惰性很致命。因为有太多的未知，啥都是从零做起，此时才发现一个良好的习惯是多么的难能可贵。因为缺少明确指导更需要自己给自己加码加限制，不然一旦跑偏就无可救药。

吐槽2：除了检验本身，实验的设计也很重要。因为方法没有经过严格的验证，测试人员对方法的熟练度有限，质量研究过程需要做好实验设计。根据实验的需求增加阴性对照或阳性对照外，必要时增加质量控制溶液。除此以外还要考虑试剂盒的适用性。

以凝胶法内毒素检查为例，原本来说有了阳性对照和阴性对照加供试品阳性，这个实验是不是就完美了呢？有没有可能因为鲎试剂灵敏度过高导致测试结果偏高呢？不可能，因为我们鲎试剂做了灵敏度复核是满足要求的，及时有误差也是可以接受的。在质量研究早期因为人员有限试剂有限，很少进行专门的试剂验收。就需要首次使用时候增加必要的适用性试验。

2.4端粒酶活性检测——PCR

2.4.1配制PCR预混液，单个PCR反应：2×PCR反应液（管号2）25μL；216bp内参标准DNA（管号3）5μL。按照需要体积配制预混液，30μL/反应孔分装至PCR管，加入对应PCR样本模板。

2.4.2PCR样本（50μL/反应孔）

供试品1：

a1.供试品S1——3μL步骤2.3.2制备供试品等量3×10^3细胞裂解产物，补水17μL至总体积50μL。

b1.供试品阴性对照S1，0——与a1等量细胞裂解产物，补水至总体积50μL。

iPSC对照细胞1：与供试品加样保持一致。

HDFn细胞对照细胞2：与供试品加样保持一致。

阳性对照样本：

低浓度阳性对照：1μL低浓度阳性参比品（管序号4），1μL裂解液（管序号1），补水至总体积50μL。

高浓度阳性对照：1μL高浓度阳性参比品（管序号5），1μL裂解液（管序号1），补水至总体积50μL。

空白对照样本：1μL裂解液（管序号1），补水至总体积50μL。

2.4.3PCR程序

2.4.4获得PCR产物备检，进行Elisa实验。

吐槽3：做分子生物实验时候PCR管太小，很难标记。此时只能去做一些序号标记，这时候只靠脑子难免会出现意外。及时书写记录成了一个必备技能。也许要选择一个做质量研究的小伙伴，他不仅要善于思考还需要稳重踏实。一个高质量的质量研究员应该是自律的。

对于扩增后的产物个人总莫名的感觉恐惧，总会冒出来会不会有气溶胶等一类的担忧。为了缓解自己的焦虑，每次扩增完开盖前我都要进行一次离心，不然我心难安。

2.5端粒酶活性检测——Elisa

2.5.1储存液、工作液配制

①1×洗液：取10×洗液(管号10)，使用无酶水稀释10倍即得

②抗体储存液：取辣根过氧化物标记绵阳抗体（管号11、120mU），加入240μL无酶水熔解至0.5U/mL

③抗体工作液：取抗体储存液②稀释50倍至10mU/mL，即得。注：临用现配。

2.5.2按照总反应数（测试样本×3），分装变性剂（管号7）10μL/支。

每个供试品需要3支变性剂，分别用于：供试品阴性对照S1,0；供试品检测S1；供试品内参照检测S1，IS。

iPSC对照细胞需要3支变性剂，同供试品。

空白对照需要1支变性剂，每个阳性对照需要2支变性剂。

2.5.3分别加入对应PCR产物2.5μL。混匀，室温放置10min。

2.5.4加入杂交液,充分混匀。

阴性对照样本、供试品检测、空白样本、阳性对照检测，加入杂交液T（管号8）100μL；

供试品内参照检测、阳性对照内参照检测，加入杂交液IS（管号9）100μL。

如示例：(成纤维细胞对照缩写Fi)

2.5.5杂交捕获

取混合液100μL至包被板孔中，封盖板膜。37℃孵育，摇床混匀（转速150~300rpm），2h。

2.5.6洗板3次

小心去除杂交液，每次使用1×洗液250μL，洗板3次，每次不低于30s。

2.5.7加入抗体孵育

加入抗体工作液（10mU/mL）100μL，封盖板膜，37℃孵育，摇床混匀（转速150~300rpm），2h。

2.5.8洗板5次

小心去除抗体工作液，每次使用1×洗液250μL，洗板5次，每次不低于30s。

2.5.9显色

加入100μL显色底液TMB（管号13），封盖板膜，避光，室温静置10~20min。10min时即可目测阳性结果呈现蓝色。

2.5.10终止显色

加入100μL显色终止液（管号14），终止反应，尽快使用酶标仪读取数据。

2.5.11读数

使用酶标仪读数，设置检测波长450nm，参比波长690nm。

2.5.12判读标准

阴性对照：通常检测值<0.1(A450,A690 )

阳性对照：低浓度阳性对照品通常检测值0.1~0.8(A450,A690)；高浓度阳性对照品通常检测值0.9~4.0(A450,A690 )

2.5.13供试品结果判断：

对比供试品样本与iPSC细胞结果 。

对比供试品样本与HDFn细胞结果。

吐槽4：没有质量标准是永远的痛，因为没有研究数据没有产品，*终的都无法确定。质量研究结束才会有*终的标准。作为一个质量研究人不得不再多看一些文献，再结合产品的用途等做出自己判断。除此以外，在结合相关的其他检验项目的结果来判断自己判断的合理性，抑或用不同原理的方法来验证自己的方法。苦逼的质量研究员，在不断的自我折磨中成长。

3.0材料和设备

3.1设备、耗材

3.1.1高速冷冻离心机

3.1.2金属浴

3.1.3PCR仪器

3.1.437℃恒温孵育混匀设备（如恒温震荡器、空气浴摇床）

3.1.5酶标仪

3.1.6各量程移液器及配套枪头、离心管、PCR管等常用耗材

3.2材料

3.2.1端粒酶活性检测试剂盒

3.2.2核糖核酸酶A

3.2.3诱导多能干细胞（iPSC细胞）

3.2.4成纤维细胞（HDFn细胞）