Ames试验 污染物致突变性检测 16886.3检测

Ames试验全称污染物致突变性检测。Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。

目的和原理

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

实验用菌株的细胞壁还有能使实验物易于渗透的突变。为了增加试验的敏感性，这些菌株的切除修复DNA的能力是缺陷的，并且还有提高错误倾向的DNA修复的质粒基因。

步骤和方法

Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。

1.菌株鉴定用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。

目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于37℃，100r/min振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为1×109个/ml~2×109个/ml。

鉴定项目:

(1)脂多糖屏障丢失(rfa)用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱，培养24h后观察结果。

(2)R因子划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿的药液不同，为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1，载有抗四环素的基因，故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。

(3)紫外线损伤修复缺陷(△uvrB)在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。

(4)自发回变预先制备底平板;向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液;混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。

(5)回变特性--诊断性试验上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。

组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。

2.斑点试验吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性;菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。

3.平板掺入试验将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个~5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比(MR)。MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。