植物酶可以提高动物的消化功能,催化机体内的生化反应,促进机体的新陈代谢,从而弥补因应激等原因消化酶分泌的减少。很多时候,类似植酸酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶等植物酶制剂会被作为很好的饲料添加剂,应用在饲料产品的生产加工里面。这时候,如果企业能够准确的把握酶活性、酶反应的相关数据就能够更好的设计一款符合市场需求的畜禽饲料。
一、方法原理分析
使用分光光度法检测植酸酶活性,原理主要是利用植酸酶在一定温度和 pH条件下,可以水解底物植酸钠,从而生成正磷酸和肌醇衍生物,只要在酸性溶液中,用钒钼酸氨处理,就会生成黄色的【( NH4) 3PO 4NH 4 VO 3 · 16M O O 3 】复合物,我们用分光光度计,在波长 415nm下进行比色测定就可以了解其酶活性。
二、检测方法步骤
1.取有代表性样品, 用四分法将试样缩分至200g, 植酸酶产品不需粉碎,配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛,装入密封容器,防止试样成分变化。
2.称取样品5000U/g的0.4~0.6g,**至0.0001g,置于250mL三角瓶中,准确加入100mL乙酸缓冲液(2),放到空气浴摇床上振荡30min或磁力搅拌器上高速搅拌30min,在离心机上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(2)稀释,使样液浓度保持在0.4U/mL左右,待反应。建议**移取上清液1mL至25mL容量瓶中,用乙酸缓冲液(2)定容,摇匀。再继续**移取1mL试液至25mL容量瓶中,定容,摇匀,稀释至31250倍。
3.取10mL试管,**移取2mL稀释液至试管中,做试样空白。将样品放入37℃水浴锅预热5min,先将空白加4mL终止液(1.3.7),再将样与空白依次加入4mL底物植酸钠(1.3.3),从加底物开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要**一致,加液后立即混匀,将其放入37℃水浴水解30min;取出后将样品各加入4mL终止液。
4.反应后的试样在室温下静置10min,如出现混浊需在离心机(1.4.7)上以4000转/min离心10min,上清液以标准曲线的空白调零在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值,A-A0为实测吸光值,用直线回归方程计算植酸酶的活性。