1.范围
本标准规定了蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、髙良姜素含量的液相色谱串联质谱和液相色谱测定方法。
本标准适用于蜂胶中芦了、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定。
本标准液相色谱-串联质谱法的检出限:芦丁为0.15g/kg;杨酶酮为0.050g/kg;槲皮素、髙良姜素为0.025g/kg;莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因为0.0060g/kg。液相色谱法的检出限:杨梅酮、莰菲醇芹菜素、苛因为0.10g/kg;芦丁、槲皮素、松属素、高良姜素为0.20g/kg。
2.规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件,其*新版本适用于本标准。
GB/T 6379 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(GB/T 6379-1986,neq ISO5725:1981)
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)
3.原理
甲醇溶解试样,反相液相色谱柱分离黄酮化合物,八种黄酮化合物用液相色谱-串联质谱仪测定或用高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定量。
4.试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇:色谱纯。
4.2 磷酸。
4.3 甲醇+水(1+1):量取50mL甲醇与50mL水混合。
4.4 芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准物质:纯度≥99%。
4.5芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准储备溶液:准确称取适量的每种标准物质(4.4),用甲醇(4.1)配制成浓度为0.10mg/mL的混合标准储备溶液。
4.6芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和髙良姜素标准工作溶液:根据需要用甲醇(4.1)和甲醇十水(4.3)将标准储备溶液(4.5)分别稀释成适当浓度的标准工作溶液。
5.仪器
5.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。
5.2 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。
5.3 温度可调超声波水浴。
5.4 注射过滤器:容积为3mL或5mL,并带有0.45μm过滤膜。
5.5 微量注射器:25μL。
6.分析步骤
6.1 试样溶液的制备
称取0.1g～0.2g试样,**到0.001g,置于50mL容量瓶内,加入40mL甲醇,在60℃的超声波水浴中,振荡40min,待样品完全溶解后,取出冷却至室温。用甲醇定容至50mL～100mL,摇匀。用注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内,摇匀后,供液相色谱仪测定。过滤的样液取1mL与1mL水混合后,供液相色谱串联质谱仪测定。
6.2 测定
6.2.1 液相色谱条件
6.2.1.1 串联质谱法
a) 色谱柱: Mightysil RP-18 3μm 150mm×4.6mm(内径)或相当者;
b) 流动相:甲醇+水(65+35),用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;
c) 流速:0.3mL/min;
d) 进样量:20μL。
6.2.1.2 紫外检测法
b) 流动相:甲醇+水(58+42),用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;
c) 流速:0.7mL/min;
d) 检测波长:270nm;
e) 进样量:10μL。
6.2.2 质谱条件
a) 扫描方式:正离子扫描;
b) 检测方式:多反应检测;
c) 电喷雾电压:4000V;
d) 雾化气压力:0.055MPa;
e) 气帘气压力:0.069MPa;
f) 辅助气流速:6L/min;
g) 离子源温度:380℃;
h) 去簇电压:100V;
i) 定性离子对、定量离子对和碰撞气能量,见表1。
