PCR-SSCP技术是一种分子生物学分析方法,由日本Orita等于1989年创建,是筛查突变的新技术。这种技术结合了PCR(聚合酶链式反应)和SSCP(单链构象多态性)的原理。
PCR技术是一种在引物参与下,由酶催化特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。它具有灵敏度高、简便、快速的特点,且对标本的纯度要求低。
而SSCP技术则基于DNA单链在中性条件下会形成特定的空间构象,这种构象在电泳时会呈现特定的电泳条带。如果DNA序列发生变化,即使只有一个碱基变化,其空间构象也可能发生改变,从而导致电泳条带的变化。因此,通过比较被检DNA与已知序列的对照DNA的电泳条带,可以判断DNA序列是否发生了变化。
PCR-SSCP技术将两者结合,首先利用PCR技术扩增目标DNA,然后将PCR产物变性为单链,并通过SSCP技术判断其电泳条带的变化,从而检测DNA序列是否存在突变。
技术原理
PCR-SSCP分析的基本步骤包括:
PCR扩增:首先,使用特定的引物对目标DNA序列进行PCR扩增。
单链构象制备:PCR产物在加热至95°C的条件下变性,使双链DNA解链为单链。单链DNA在较低温度(通常在50-65°C之间)下复性,此时其构象稳定。
凝胶电泳分析:将复性的单链DNA加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。由于单链DNA的构象差异,它们在凝胶中的迁移率会有所不同,从而实现分离。
染色和分析:通常使用银染或荧光染料对凝胶进行染色,然后通过成像系统进行分析,观察单链DNA的迁移模式。
应用
PCR-SSCP技术广泛应用于:
基因突变检测:通过比较野生型和突变型DNA的迁移模式,来识别序列中的变化。
遗传多样性分析:研究不同个体或种群间的遗传差异。
疾病相关基因研究:寻找与特定疾病相关的基因突变。
进化研究:分析物种间或物种内的遗传差异。
优点与局限性
优点:PCR-SSCP方法简单、快速、成本低,不需要复杂的设备。
局限性:该技术的灵敏度和特异性相对较低,对于大规模的突变检测可能不够jingque。此外,它不能确定具体的突变类型。