食品安全国家标准
食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
1范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
5操作步骤
5.1―样品制备
5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃~5 ℃保存:如 8 h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料)，并尽快至于-60 ℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2以无菌操作称取25 g(mL)样品放入含有225 mL0.1%蛋白陈水（如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200 mL0.1%蛋白陈水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质lmin~2 min;或置于盛有225 mL0.1%蛋白陈水的均质杯中，8 000 r/min~10 000 r/min均质1min~2min，作为1:10稀释液。
5.1.3以上述1:10稀释液按l mL加0.1%蛋白陈水9 mL制备102~10°的系列稀释液。
5.2培养
5.2.1吸取各稀释液1 mL加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC琼脂（可放置于50℃土1℃恒温水浴箱中保温〉15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
5.2.2 上述琼脂平板凝固后，再加10 mL冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。
5.2.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1 ℃培养20 h~24 h.5.2.4典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
5.3确证试验
5.3.1︰从单个平板上任选5个(小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃1℃培养18 h~24 h。
5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种TSC琼脂平板进行分纯,36℃士1℃厌氧培养20 h~24 h,挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃土1℃培养18 h~24h，用于后续的确证试验。
5.3.3取生长旺盛的FTG培养液1 mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃土0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
5.3.4︰用接种环(针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2 mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃土1℃培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄,表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置lh,检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。
