葡萄球菌肠毒素检验
B.1试剂和材料
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T6682对一级水的规定。B.1.1A、B,C,D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒。
B.1.2pH试纸,范围在3.5~8.0,精度0.1。
B.1.3 0.25 mol/L,pH 8.0的Tris缓冲液:将121.1 g的Tris溶解到800mL的去离子水中,待温度冷至室温后,加42 mL浓 HCL,调pH 至8.0。
B.1.4 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液:称取NaHPO。·H.O 0.55 g(或NaH.PO、·2HO 0.62g)、Nag HPO,·2HO 2.85g(或NaHPO,·12H,O 5.73 g),NaCl 8.7g溶于 l 000mL蒸馏水中,充分混匀即可。
B.1.5―庚烷。
B.1.610%次氦酸钠溶液。
B.1.7肠毒素产毒培养基
B.3―原理
本方法可用A、B,C,D,E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成。本方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(EL.ISA)。96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A、B.C,D,E型葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控，包被了非免疫动物的抗体。样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加人反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。
B.4检测步骤
B.4.1从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法
待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18 mm×180 mm)36 ℃培养24 h,用5 mL生理盐水洗下菌落，倾人60mL产毒培养基中,36 ℃振荡培养48 h,振速为100 次/min,吸出菌液离心,8 000 r/ min20 min,加热 100℃,10 min,取上清液,取100 pL稀释后的样液进行试验。
B.4.2从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法
B.4.2.1 牛奶和奶粉
将25 g奶粉溶解到125 mL,0.25 M,pH8.0的Tris缓冲液中,混匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备。将牛奶于15℃,3 500g 离心10 min。将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶。用蒸馏水对其进行稀释( 1: 20)。取100,.L稀释后的样液进行试验。
B.4.2.2脂肪含量不超过40%的食品
称取10g样品绞碎,加入pH7.4的PBS液15 mL进行均质。振摇15 min。于 15 ℃,3 500g离心
10 min。必要时,移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取100 pL.的滤出液进行试验。
B.4.2.3脂肪含量超过40%的食品
称取10g样品绞碎,加入pH7.4的PBS液15 mL进行均质。振摇15 min。于 15 ℃,3 500g离心10min。吸取5 mL上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入 5 mL的庚烷,充分混匀5 min。于15 ℃,3 500g离心5min。将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷。将下部水相层进行过滤除菌。取100 ,.L的滤出液进行试验。
B.4.2.4其他食品可酌情参考上述食品处理方法。
